Eine kurze Diskussion über die chemische Synthese von Oligonukleotid-Arzneimitteln und Phosphorreagenzien-CTPPA

(Phosphorreagenzien-CTPPA:2-Cyanoethyl N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiaMidite CAS-Nr.:102691-36-1)

Das Gebiet der Nukleinsäure-Arzneimittel hat in den letzten Jahren große Aufmerksamkeit erregt. Die Zulassung und Einführung von Nukleinsäure-Medikamenten hat sich beschleunigt, und für eine Reihe solcher Medikamente mit dem Potenzial, Blockbuster-Produkte zu werden, wurden klinische Daten veröffentlicht, die Bereiche wie Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen, Lebererkrankungen und verschiedene seltene Krankheiten abdecken. Bis zum ersten Halbjahr 2025 wurden insgesamt 22 kleine Nukleinsäure-Medikamente (einschließlich derjenigen, die bereits vom Markt genommen wurden) für die weltweite Vermarktung zugelassen, darunter 13 ASO-Medikamente, 7 siRNA-Medikamente und 2 ligandenbasierte Medikamente.

In Bezug auf die Klassifizierung machen ASO-Medikamente den größten Anteil aus, wobei 13 vermarktete Medikamente 59,09 % der Gesamtmenge ausmachen. Es folgen siRNA-Medikamente, wobei 7 vermarktete Medikamente einen Anteil von 31,81 % ausmachen. Aus Sicht der Indikationen zielen 17 Medikamente auf seltene genetische Erkrankungen ab, 3 konzentrieren sich auf Augenerkrankungen, 1 auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen und 1 auf hämatologische onkologische Komplikationen. Die Indikationsverteilung weist ein Muster auf, bei dem „seltene Krankheiten im Mittelpunkt stehen, mit Durchbrüchen in mehreren Bereichen“. Es ist offensichtlich, dass sich die klinische Anwendung kleiner Nukleinsäuremedikamente allmählich über den Bereich seltener Krankheiten hinaus auf andere Krankheitsbereiche ausdehnt.

Mit der zunehmenden Forschung zu Nukleinsäure-Arzneimitteln wird die Produktion verschiedener Oligonukleotid-Arzneimittel in großem Maßstab allmählich zu einem Zukunftstrend werden, wobei die chemische Synthese die wichtigste Methode zur Synthese kurzkettiger Oligonukleotide darstellt. Nach mehr als einem halben Jahrhundert Entwicklung haben sich die chemischen Synthesemethoden für Oligonukleotide von der anfänglichen Phosphodiester-Methode über die Phosphotriester- und Phosphit-Methode bis hin zur derzeit ausgereiften Phosphoramidit-Methode weiterentwickelt. Ähnlich wie die Peptidsynthese kann auch die Oligonukleotidsynthese aus einer anderen Perspektive in Lösungs--Phasen-Synthese und Fest--Phasen-Synthese unterteilt werden. In diesem Artikel werden die am häufigsten verwendeten „Phosphorreagenzien“ und ihre Anwendungen in der Nukleosidmonomersynthese vorgestellt.

Abbildung 1 Phosphitylierreagenzien und Aktivierungsreagenzien

Bei der Synthese von Oligonukleotiden ist die Herstellung von Nukleosidmonomeren ein unverzichtbarer Schritt. Derzeit gibt es zwei Hauptphosphitylierungsmittel, die häufig zur Synthese verschiedener Nukleosidmonomere verwendet werden: eines ist 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (1) [1]; das andere ist Bis(diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)phosphin (2) (Abbildung 1). [2]. 2-Cyanoethyl N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (1) weist die höchste Reaktivität auf und kondensiert leicht mit Alkoholen. Im Gegensatz dazu erfordert Bis(diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)phosphin (2) eine durch schwach saure Reagenzien wie Tetrazol katalysierte In-situ-Aktivierung, bevor es mit Alkoholen kondensieren kann (Abbildung 1). Aus praktischer Sicht ist 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (1) teurer als Bis(diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)phosphin (2). Aufgrund seiner hohen Reaktivität ist 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (1) anfälliger für den Abbau, was seine Verwendung und Lagerung umständlich macht. Außerdem führt es während der Reaktion tendenziell zu zusätzlichen Verunreinigungen, was zu weniger idealer Reinheit und Ausbeute führt. Daher ist Bis(diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)phosphin (2) derzeit das am häufigsten verwendete Phosphitylierungsmittel bei der Herstellung von Nukleosidmonomeren und wird oft als „Phosphorreagenz“ abgekürzt.

Abbildung 2 Reaktionsmechanismus der durch Tetrazol-katalysierten Phosphitylierung

Beim Kondensationsprozess zwischen „Phosphorreagenzien“ und Alkoholen wird üblicherweise eine stöchiometrische oder unterstöchiometrische Menge eines Aktivierungsreagenzes zugesetzt. Zu den am häufigsten verwendeten Aktivierungsreagenzien gehören Tetrazol, 4,5-Dicyanimidazol und Pyridiniumtrifluoracetat [3,4]. Derzeit wurde der Mechanismus der durch Tetrazol katalysierten Kondensationsreaktion zwischen „Phosphorreagenzien“ und Alkoholen gründlich untersucht [5-7].

Die Reaktion läuft wie folgt ab: Zunächst wird das „Phosphorreagenz“ protoniert; dann wird Diisopropylamin durch Tetrazol ersetzt; Anschließend wird Tetrazol durch den Alkohol ersetzt (Abbildung 2). Unter diesen Schritten ist die Substitution von Diisopropylamin durch Tetrazol der geschwindigkeitsbestimmende Schritt.

Unter den drei oben genannten Aktivierungsreagenzien hat Tetrazol die stärkste Acidität (pKa=4.89) [3], die mit der von Essigsäure (pKa=4.74) vergleichbar ist. Im Gegensatz dazu weisen 4,5-Dicyanoimidazol (pKa=5.20) [3] und Pyridiniumtrifluoracetat (pKa=5.23) ​​[3] eine schwächere Säure auf.

Da die 5'-Hydroxylgruppe in Nukleosidmonomeren typischerweise durch die säurelabile 4,4'-Dimethoxytritylgruppe (DMT) geschützt ist, kann die Verwendung von Tetrazol mit der Nebenreaktion der DMT-Entschützung einhergehen. Daher sind 4,5-Dicyanimidazol (pKa=5.20) und Pyridiniumtrifluoracetat (pKa=5.23) manchmal die idealere Wahl.

Darüber hinaus haben Koch et al. berichteten, dass bei Verwendung von 4,5-dicyanoimidazol als Aktivierungsreagenz eine vollständige Umwandlung mit nur 0,7 Äquivalenten des Reagens erreicht werden kann. Im Gegensatz dazu besteht bei der Verwendung von mehr als einem Äquivalent die Gefahr der Bildung von Dimer-Nebenprodukten [4].

Eigenschaften von „Phosphorreagenz-CTPPA“

„Phosphorreagenz“ ist eine farblose oder blassgelbe Flüssigkeit mit einem relativ hohen Siedepunkt (115 Grad /0,6 Torr). Es reagiert empfindlich auf Sauerstoff und Feuchtigkeit und neigt bei der Vakuumdestillation dazu, sich leicht zu zersetzen, was die Produktion dieses Produkts im großen Maßstab zu einer Herausforderung macht. Aufgrund seiner besonderen Eigenschaften bereitet die Qualitätsprüfung von Phosphorreagenzien jedoch auch erhebliche Schwierigkeiten. Benutzer sollten das Reagenz nach jedem Gebrauch mit Stickstoff schützen und in einem Exsikkator aufbewahren. Diese Vorgehensweise kann die Lebensdauer des Reagenzes verlängern.

Unser Unternehmen ist seit fast einem Jahrzehnt in der Forschung, Entwicklung und Produktion von Phosphorreagenzien tätig und verfügt über umfassende Erfahrung in der Herstellung und Prüfung des Produkts. Derzeit können wir hochreines „Phosphorreagenz“ im Kilogrammmaßstab liefern. Darüber hinaus bieten wir auch verwandte Produkte wie Tetrazol und 4,5-Dicyanimidazol an. Wir heißen Freunde mit entsprechenden Bedürfnissen willkommen, uns zu kontaktieren (Tabelle 1).

Tabelle 1 Relevante Produkte, die von unserem Unternehmen hergestellt und verkauft werden

Referenzen

[1] Sinha, ND; McManus, J.; Köster, H. Nucleic Acids Research 1984, 12, 4539.

[2] Nielsen, J.; Taagaard, M.; Marugg, JE, et al. Nucleic Acids Research 1986, 14, 7391.

[3] Sanghvi, YS; Guo, Z.; Pfundheller, HM, et al. Organic Process Research Development 2000, 4, 175.

[4] Pedersen DS; Rosenbohm C.; Koch T. Synthesis 2002, 802.

[5] Nurminen, EJ; Mattinen, JK; Lönnberg, H. Journal of Chemical Society, Perkin Transactions 2, 1998, 162.

[6] Berner, S.; Mühlegger, K.; Seliger, H. Nucleic Acids Research 1989, 17, 853.

[7] Dahl, BM; Nielsen, J.; Dahl, O. Nucleic Acids Research 1987, 15, 1729.